αΩ spacer spacer spacer ΕΝΗΜΕΡΩΤΙΚΟ ΔΕΛΤΙΟ spacer ΤΕΥΧΟΣ 29 spacer ΣΕΠΤΕΜΒΡΙΟΣ 2005
Επιστροφή στην σελίδα των Περιεχομένων Επικοινωνία
spacer
spacer
spacer
spacer
 
spacer
spacerΕικόνα 1. Μικροσκοπική μορφολογία του μυκοβακτηριδίου της φυματίωσης (Μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης) (αστερίσκοι), όπως φαίνεται ύστερα από την οξεάντοχη χρώση Ziehl-Neelsen κλινικού δείγματος. To μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης χρωματίζεται ροζ σε αντίθεση με τα υπόλοιπα συστατικά του παρασκευάσματος που χρωματίζονται μπλε (Μεγέθυνση: 100Χ). Επεξεργασία εικόνας: Κόντος Φανούρης, Αθήνα 2005.
spacer

Εικόνα 1. Μικροσκοπική μορφολογία του μυκοβακτηριδίου της φυματίωσης (Μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης) (αστερίσκοι), όπως φαίνεται ύστερα από την οξεάντοχη χρώση Ziehl-Neelsen κλινικού δείγματος. To μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης χρωματίζεται ροζ σε αντίθεση με τα υπόλοιπα συστατικά του παρασκευάσματος που χρωματίζονται μπλε (Μεγέθυνση: 100Χ). Επεξεργασία εικόνας: Κόντος Φανούρης, Αθήνα 2005.

spacer
Eργαστηριακή διάγνωση της φυματίωσης: Nεότερα δεδομένα
spacer
spacer

του Φανούρη Kόντου

spacer

Βιολόγου, PhD

spacer
spacer
άρθρο
spacer
spacer
spacer
H φυματίωση εξακολουθεί ακόμη και σήμερα να αποτελεί ένα από τα πιο σημαντικά αίτια θνησιμότητας παγκοσμίως. Σύμφωνα με δεδομένα του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας, κάθε χρόνο καταγράφονται περίπου 8 εκατομμύρια νέα κρούσματα με περισσότερους από δύο εκατομμύρια θανάτους. Η ασθένεια αυτή αποτελεί πολύ σοβαρό πρόβλημα στις αναπτυσσόμενες χώρες, όπου καταγράφεται ετησίως το 95% των νέων κρουσμάτων και τα ποσοστά θνησιμότητας ανέρχονται περίπου στο 26%.

spacer

Τα τελευταία χρόνια, περίπου από τα μέσα της δεκαετίας του ΄80, παρατηρείται σταδιακή αύξηση του αριθμού των κρουσμάτων και στις αναπτυγμένες χώρες. Αυτό οφείλεται κατά κύριο λόγο: α) στην αύξηση του αριθμού των μεταναστών και των προσφύγων, που προέρχονται από χώρες στις οποίες η φυματίωση είναι ενδημική και μεταφέρουν την ασθένεια στις χώρες προορισμού τους, και β) στην αύξηση του ποσοστού των ανοσοκατεσταλμένων ασθενών, όπως οι ασθενείς που πάσχουν από AIDS, οι ασθενείς που υποβάλλονται σε χημειοθεραπεία καθώς και οι ασθενείς που βρίσκονται σε ανοσοκαταστολή λόγω μεταμόσχευσης. Στους ασθενείς αυτούς, λόγω της αδυναμίας τού ανοσοποιητικού τους συστήματος να αντιδράσει σε λοιμογόνους παράγοντες, η ασθένεια είναι περισσότερο επιθετική.

Το παθογόνο αίτιο της φυματίωσης είναι το οξεάντοχο βακτηρίδιο μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης (Mycobacterium tuberculosis). Τα τελευταία χρόνια, όμως, παρατηρούνται κρούσματα λοίμωξης, ιδίως σε ανοσοκατεσταλμένους ασθενείς, και από άλλα είδη μυκοβακτηριδίων («άτυπα μυκοβακτηρίδια») τα οποία παρουσιάζουν ενδογενή αντοχή στα συνήθη αντιφυματικά φάρμακα.

spacer Εικόνα 2. Μικροσκοπική μορφολογία του μυκοβακτηριδίου της φυματίωσης (Μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης), όπως φαίνεται ύστερα από χρώση Ziehl-Neelsen μικροοργανισμών που αναπτύχθηκαν σε υγρή καλλιέργεια. Oι μικροοργανισμοί κατά τη διαίρεση τους δεν διαχωρίζονται και δημιουργούν αυτούς τους νηματοειδείς σχηματισμούς (Μεγέθυνση: 40Χ). Επεξεργασία εικόνας: Κόντος Φανούρης, Αθήνα 2005.
spacer

Εικόνα 2. Μικροσκοπική μορφολογία του μυκοβακτηριδίου της φυματίωσης (Μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης), όπως φαίνεται ύστερα από χρώση Ziehl-Neelsen μικροοργανισμών που αναπτύχθηκαν σε υγρή καλλιέργεια. Oι μικροοργανισμοί κατά τη διαίρεση τους δεν διαχωρίζονται και δημιουργούν αυτούς τους νηματοειδείς σχηματισμούς (Μεγέθυνση: 40Χ). Επεξεργασία εικόνας: Κόντος Φανούρης, Αθήνα 2005.

spacer

Ένα άλλο πολύ σημαντικό πρόβλημα, που σχετίζεται με την επανεμφάνιση της ασθένειας, είναι το γεγονός ότι παρατηρείται αύξηση του ποσοστού των στελεχών του μυκοβακτηριδίου της φυματίωσης τα οποία εμφανίζουν αντοχή στα αντιφυματικά φάρμακα, καθιστώντας τη θεραπεία της ακόμα πιο δύσκολη. Επομένως, είναι ζωτικής σημασίας για τη δημόσια υγεία η έγκαιρη διάγνωση της φυματίωσης, ώστε αφενός να απομονωθούν οι ασθενείς που πάσχουν και να σταματήσει η περαιτέρω εξάπλωσή της, και αφετέρου να ξεκινήσει ταχύτατα η θεραπεία, που -στις περιπτώσεις των ανοσοκατεσταλμένων ασθενών- η παραμικρή καθυστέρηση μπορεί να αποβεί μοιραία. Σε αυτή την κατεύθυνση το σύγχρονο εργαστήριο καλείται να δώσει ζωτικής σημασίας λύσεις που αφορούν: στην άμεση ανίχνευση του μικροοργανισμού στο κλινικό δείγμα, στην ταυτοποίηση των στελεχών που απομονώθηκαν από την καλλιέργεια και στην ανίχνευση της αντοχής σε αντιμικροβιακούς παράγοντες.

Οι κλασσικές μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση των μυκοβακτηριδίων στα κλινικά δείγματα είναι οι οξεάντοχες χρώσεις στο άμεσο παρασκεύασμα (Εικόνα 1) και οι καλλιέργειες στα ειδικά θρεπτικά υλικά (Εικόνα 2). Οι οξεάντοχες χρώσεις μπορεί να δίνουν αποτέλεσμα μέσα σε λίγες ώρες, αλλά είναι μη ειδικές μέθοδοι και χαρακτηρίζονται από χαμηλή ευαισθησία. Από την άλλη, οι καλλιέργειες παρουσιάζουν άριστη ειδικότητα και μεγάλη ευαισθησία, αλλά απαιτούν μεγάλο χρόνο επώασης. Τα τελευταία χρόνια γίνονται προσπάθειες μείωσης του χρόνου που απαιτείται για την απομόνωση των μυκοβακτηριδίων από τα κλινικά δείγματα με τη χρήση υγρών καλλιεργητικών υλικών. Παρόλη, όμως, τη συνεχή βελτίωση των καλλιεργητικών υλικών και μεθόδων, το μεγάλο πρόβλημα της εργαστηριακής διάγνωσης της φυματίωσης εξακολουθεί να παραμένει ο παρατεταμένος χρόνος επώασης των καλλιεργειών (6-8 εβδομάδες), καθώς και η χαμηλή ευαισθησία της εξέτασης όσον αφορά στην εξωπνευμονική φυματίωση (φυματίωση η οποία προσβάλλει άλλα όργανα του οργανισμού, όπως νεφρούς, οστά, δέρμα κ.ά.).

Σε αυτή την κατεύθυνση η μοριακή βιολογία έρχεται να παίξει σημαντικό ρόλο με την ανάπτυξη δοκιμασιών που βοηθούν στην ανίχνευση του μυκοβακτηριδίου της φυματίωσης στα κλινικά δείγματα, στοχεύοντας στο γενετικό του υλικό. Κάποιες από τις δοκιμασίες αυτές έχουν προτυποποιηθεί και είναι εμπορικά διαθέσιμες, ενώ άλλες έχουν αναπτυχθεί από το ίδιο το εργαστήριο και εφαρμόζονται σε διαγνωστικό ή σε ερευνητικό επίπεδο. Το πρώτο στάδιο σε όλες τις δοκιμασίες περιλαμβάνει τη λύση του μικροβιακού κυττάρου και την απελευθέρωση του γενετικού του υλικού (DNA ή RNA). Ακολουθεί η in vitro σύνθεση μεγάλου αριθμού αντιγράφων μιας αλληλουχίας νουκλεοτιδίων (αλληλουχία στόχος) που ανήκει στο γενετικό υλικό του μυκοβακτηριδίου της φυματίωσης. Η αλληλουχία που πολλαπλασιάζεται είναι ειδική για τον μικροοργανισμό και είναι τμήμα είτε ενός γονιδίου, είτε κάποιου λειτουργικού μορίου, είτε του μεταθετού στοιχείου IS6110. Ο εκθετικός πολλαπλασιασμός της αλληλουχίας στόχου επιτελείται είτε μέσω της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (PCR), όταν το γενετικό υλικό είναι το DNA, είτε μέσω της διαδικασίας της μεταγραφής (TMA) όταν το γενετικό υλικό είναι το RNA.

Η ανίχνευση των αντιγράφων τής αλληλουχίας στόχου μπορεί να πραγματοποιηθεί με διάφορους τρόπους. Ο πιο απλός είναι η ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης και η ταυτοποίηση του προϊόντος με βάση το μέγεθός του. Αυτή η τεχνική εφαρμόζεται σε ερευνητικό επίπεδο, αλλά δεν μπορεί να δώσει πληροφορίες για την ειδικότητα του προϊόντος. Για τον λόγο αυτό χρησιμοποιούνται συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια των οποίων η αλληλουχία είναι συμπληρωματική με κάποιο τμήμα της αλληλουχίας στόχου και είναι σημασμένα με κάποιο μόριο (π.χ. βιοτίνη). Ακολουθεί υβριδισμός μεταξύ ιχνηθέτη-αλληλουχίας στόχου και με τη χρήση των κατάλληλων αντιδραστηρίων ο σχηματισμός του υβριδοποιημένου μορίου, εάν έχει πραγματοποιηθεί, ανιχνεύεται είτε με την παραγωγή κάποιου εγχρώμου προϊόντος, είτε με την παραγωγή φωτός (χημειοφωταύγεια), είτε με την παραγωγή φθορισμού. Εναλλακτικά, σε κάποιες άλλες δοκιμασίες γίνεται απευθείας πολλαπλασιασμός του σημασμένου ιχνηθέτη (LCR κ.ά.).

Οι μοριακές «in house» μέθοδοι παρουσιάζουν το πλεονέκτημα του χαμηλότερου κόστους, αλλά επειδή απαιτούν ειδική τεχνογνωσία και τεχνική υποδομή παρατηρούνται μεγάλες διακυμάνσεις στην ευαισθησία (2-100%) και στην ειδικότητα τους (23-97%) από εργαστήριο σε εργαστήριο. Επίσης, παρουσιάζουν και κάποια μειονεκτήματα, όπως: ο κίνδυνος επιμολύνσεων μεταξύ των δειγμάτων, η αποτυχία τους να ανιχνεύσουν την ύπαρξη άλλων ειδών μυκοβακτηριδίων εκτός από το μυκοβακτηρίδιο της φυματίωσης που πιθανώς να υπάρχουν στο δείγμα, η κλινική τους αξιολόγηση είναι διαφορετική από αυτή των καλλιεργειών (αντίθετα από τις καλλιέργειες ανιχνεύουν και νεκρούς μικροοργανισμούς), ενώ δεν ενδείκνυται η χρήση τους όταν ο ασθενής είναι κάτω από αντιφυματική αγωγή. Επιπλέον, κάποιες από αυτές είναι περίπλοκες, απαιτούν ειδικό υλικοτεχνικό εξοπλισμό και έχουν μεγάλο κόστος. Θα πρέπει να τονιστεί ότι οι μοριακές δοκιμασίες παίζουν επικουρικό ρόλο για την ανίχνευση του μυκοβακτηριδίου της φυματίωσης στα κλινικά δείγματα και σε καμία περίπτωση δεν μπορούν να αντικαταστήσουν την καλλιέργεια. Επομένως, ανεξαρτήτως του αποτελέσματος της μοριακής δοκιμασίας θα πρέπει να απομονωθεί το μυκοβακτηρίδιο από το κλινικό δείγμα, ώστε να γίνει στη συνέχεια η ταυτοποίησή του, καθώς και ο έλεγχος ευαισθησίας του στα συνήθη αντιφυματικά φάρμακα.

Εικόνα 3. Ταυτοποίηση ειδών μυκοβακτηριδίων με τη μέθοδο PCR-RFLP. Στη δοκιμασία αυτή αρχικά πραγματοποιείται, μέσω της PCR, ο πολλαπλασιασμός ενός τμήματος του γονιδίου rpoB, μεγέθους 342 ζευγών βάσεων (bp) (Β13). Ακολουθεί πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα Hind II (A1, Α5, B1, Β5, Β9), Hae III (A 2, Α6,B2, Β6, Β10), MvaI (A3, Α7, B3, Β7, Β11), και AccII (A4, Α8, B4, Β8, Β12), ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης, επώαση με  βρωμιούχο αιθίδιο και παρατήρηση σε υπεριώδη ακτινοβολία. Τα είδη που ταυτοποιήθηκαν με αυτή τη δοκιμασία είναι το Μycobacterium tuberculosis (A1 - Α4), το Μycobacterium avium (A5-Α8, B9-Β12), το Μycobacterium intracellulare (B1 - Β4) και το Μycobacterium malmoense (B5-Β8). Παράλληλα ηλεκτροφορήθηκαν και τμήματα DNA γνωστών μεγεθών (Μ). Όπως φαίνεται από την εικόνα στα διαφορετικά είδη αντιστοιχούν διαφορετικά προϊόντα. Επεξεργασία εικόνας: Κόντος Φανούρης, Αθήνα 2005.
spacer

Εικόνα 3. Ταυτοποίηση ειδών μυκοβακτηριδίων με τη μέθοδο PCR-RFLP. Στη δοκιμασία αυτή αρχικά πραγματοποιείται, μέσω της PCR, ο πολλαπλασιασμός ενός τμήματος του γονιδίου rpoB, μεγέθους 342 ζευγών βάσεων (bp) (Β13). Ακολουθεί πέψη με τα περιοριστικά ένζυμα Hind II (A1, Α5, B1, Β5, Β9), Hae III (A 2, Α6,B2, Β6, Β10), MvaI (A3, Α7, B3, Β7, Β11), και AccII (A4, Α8, B4, Β8, Β12), ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης, επώαση με βρωμιούχο αιθίδιο και παρατήρηση σε υπεριώδη ακτινοβολία. Τα είδη που ταυτοποιήθηκαν με αυτή τη δοκιμασία είναι το Μycobacterium tuberculosis (A1 - Α4), το Μycobacterium avium (A5-Α8, B9-Β12), το Μycobacterium intracellulare (B1 - Β4) και το Μycobacterium malmoense (B5-Β8). Παράλληλα ηλεκτροφορήθηκαν και τμήματα DNA γνωστών μεγεθών (Μ). Όπως φαίνεται από την εικόνα στα διαφορετικά είδη αντιστοιχούν διαφορετικά προϊόντα. Επεξεργασία εικόνας: Κόντος Φανούρης, Αθήνα 2005.

Τα τελευταία χρόνια έχουν αναπτυχθεί μοριακές δοκιμασίες ταυτοποίησης που στηρίζονται στις διαφορές (γονίδια ή μεταλλάξεις) που υπάρχουν στο γενετικό υλικό των μυκοβακτηριδίων. Κάποιες δοκιμασίες περιλαμβάνουν τον άμεσο υβριδισμό ενός τμήματος γονιδίου χαρακτηριστικού για κάποιο είδος μυκοβακτηριδίου με ειδικούς ιχνηθέτες και την ανίχνευση του υβριδοποιημένου μορίου με χημειοφωταύγεια. Κάποιες άλλες περιλαμβάνουν τον πολλαπλασιασμό μέσω της PCR του τμήματος ενός γονιδίου (rpoB, hsp65, 23S rRNA) είτε κάποιας αλληλουχίας (16S-23S rRNA) κοινών για όλα τα είδη του γένους Mycobacterium. Η αλληλουχία του προϊόντος είναι χαρακτηριστική για το κάθε είδος. Στη συνέχεια ακολουθεί είτε η εύρεση της αλληλουχίας (sequencing) του προϊόντος και ο συσχετισμός της με γνωστές βάσεις δεδομένων, είτε η επίδραση με περιοριστικά ένζυμα και ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης όπου διαφορετικές αλληλουχίες δίνουν διαφορετικά προϊόντα (PCR-RFLP, Εικόνα 3), είτε υβριδισμός με ιχνηθέτες που είναι προσκολλημένοι σε ταινίες νιτροκυτταρίνης (σε διαφορετικές θέσεις της ταινίας είναι προσκολλημένοι ιχνηθέτες ειδικοί για το κάθε είδος) και το τελικό αποτέλεσμα είναι παραγωγή έγχρωμου προϊόντος στις θέσεις της ταινίας που αντιστοιχούν στο συγκεκριμένο είδος. Από μελέτες που έχουν γίνει στη βιβλιογραφία αναφέρεται ότι παραπάνω δοκιμασίες είναι αρκετά αξιόπιστες και μειώνουν σημαντικά τον χρόνο (4-48 ώρες) που απαιτείται για να ολοκληρωθεί η ταυτοποίηση των μυκοβακτηριδίων.

Συμπερασματικά η εφαρμογή των μοριακών δοκιμασιών αναμένεται ότι τα επόμενα χρόνια θα δώσει σημαντικές λύσεις στην εργαστηριακή διάγνωση της φυματίωσης, συμπληρώνοντας ή αντικαθιστώντας κλασικές, συμβατικές τεχνικές. Θα πρέπει, όμως, να τονιστεί ότι η εφαρμογή αυτών των δοκιμασιών δεν αποτελεί πανάκεια και τα αποτελέσματά τους δεν πρέπει να αξιολογούνται ανεξάρτητα από τα αποτελέσματα των κλασσικών μεθόδων. Χρειάζεται, επίσης, στενή συνεργασία μεταξύ κλινικών και εργαστηριακών γιατρών, ώστε να τίθενται πάντα οι σωστές ενδείξεις για την εφαρμογή των μοριακών μεθόδων στη διάγνωση της φυματίωσης στα κλινικά δείγματα.

spacer
spacer spacer spacer spacer 36-39
spacer
spacer
spacer
| ΠΕΡΙΕΧΟΜΕΝΑ ΤΕΥΧΟΥΣ | ΠΑΛΑΙΟΤΕΡΑ ΤΕΥΧΗ | ΚΟΙΝΩΦΕΛΕΣ ΙΔΡΥΜΑ ΑΛΕΞΑΝΔΡΟΣ Σ. ΩΝΑΣΗΣ